L'azione si svolge a Roma nel Giugno 1800.
Chiesa di Sant'Andrea della Valle. Cesare Angelotti, console della Repubblica Romana abbattuta dall'esercito borbonico, perseguitato politico evaso dalla fortezza di Castel Sant'Angelo, si rifugia nella chiesa dove la sorella, marchesa Attavanti, gli ha lasciato l'occorrente per la fuga nascosto nella cappella della nobile famiglia. Frettolosamente Angelotti rintraccia la chiave della cappella e scompare nell'ombra. Nel frattempo arriva il vecchio sagrestano recando con sè i pennelli risciacquati per conto del pittore Cavaradossi che sta dipingendo un'immagine di Maria Maddalena nella quale il sagrestano nota la somiglianza con una misteriosa devota che frequenta assiduamente la chiesa (in realtà è la marchesa Attavanti). Prima di riprendere il lavoro Mario si sofferma a contemplare il quadro e lo confronta con un'immagine di Tosca (Recondita armonia). Il sagrestano borbotta indignato per la parole di Mario, ma il pittore riesce a farlo tacere offrendogli il paniere della sua colazione intatto. Quando Cavaradossi resta solo, Angelotti esce dal suo nascondiglio e scorge il pittore in cui riconosce un suo vecchio amico e seguace delle stesse idee liberali. Ma una voce imperiosa annuncia l'arrivo di Tosca, celebre cantante, amante di Mario (Mario, Mario!). Angelotti si nasconde nuovamente. Tosca, è insospettita dai sussurri che ha udito mentre entrava nella chiesa per proporre a Mario di trascorrere la sera nel loro nido d'amore (Non la sospiri...). Caravadossi affretta il colloquio con la scusa del lavoro, in realtà si vuole occupare al più presto dell'amico nascosto. Tosca sta per avviarsi quando riconosce nel dipinto l'immagine dalla marchesa Attavanti e avvampando di gelosia, immagina una tresca ai suoi danni. Abilmente il pittore riesce ad allontanarla. Frattanto l'evasione di Angelotti è stata scoperta e viene dato l'allarme con un colpo di cannone. Senza altri indugi Cavaradossi decide di nascondere l'amico nella sua villa e lo accompagna. I due si allontanano uscendo da una porta laterale. Ritorna il sagrestano con la notizia della sconfitta dell'odiato Napoleone: la chiesa si riempie per il solenne Te Deum di ringraziamento. Entra Scarpia, il capo della polizia accompagnato da alcuni sbirri. Una sommaria perquisizione e la scoperta di un ventaglio della marchesa Attavanti persuadono Scarpia che Angelotti è passato di lì e che il pittore, il cui quadro è un vero
e proprio ritratto della sorella dell'evaso, è implicato nella fuga del rivoluzionario. A Tosca che, tornata sui suoi passi per rimandare l'appuntamento poiché a palazzo Farnese è stata indetta una veglia di gala alla quale Tosca non può assolutamente mancare, è stupita di non trovare più Cavaradossi, Scarpia mostra il ventaglio dell'Attavanti, riattizzando la gelosia della donna. Tosca impetuosamente si precipita verso la villa dell'amante, dove pensa di sorprenderlo con la presunta rivale, e non si accorge di essere pedinata da Spoletta. Nella chiesa viene intonato il Te Deum di ringraziamento per la vittoria su Napoleone. Inginocchiandosi, Scarpia medita un piano diabolico: giustizierà i due sovversivi e farà sua Tosca, invano corteggiata in passato (Va' Tosca, nel tuo cor si annida Scarpia!).

Scarpia, nella suo appartamento a palazzo Farnese, siede a tavola per il pranzo e assapora cupamente il successo del suo piano. Da un'altra parte del palazzo giungono attraverso la finestra aperta i suoni di una festa, cui Tosca prende parte, per celebrare la recente vittoria. Scarpia decide di inviare un biglietto dal contenuto ricattatorio a Tosca.
Frattanto viene introdotto Cavaradossi tratto in arresto dagli sbirri di Scarpia sicuri che il pittore sappia dove Angelotti è nascosto. Accorre Tosca, allarmata dal contenuto del biglietto. Cavaradossi, che aveva messo al corrente Tosca dell'accaduto ha appena il tempo di imporle il silenzio prima di essere condotto nella stanza della tortura. La donna, incapace di sopportare le urla di dolore di Mario, cede rivelando il nascondiglio di Angelotti. Dagli ordini che Scarpia impartisce ai suoi sbirri Cavaradossi capisce che Tosca ha parlato e la maledice per essersi dimostrata così debole. Giunge intanto la notizia, annunciata dal gendarme Sciarrone, che Napoleone a Marengo ha ribaltato le sorti della battaglia. Cavaradossi, ricondotto nella stanza, prorompe in un inno alla libertà (Vittoria, Vittoria). Scarpia infastidito lo fa allontanare. Tosca chiede pietà a Scarpia: è disposta a pagare qualunque prezzo per la vita dell'amato. Scarpia, implacabile, osserva che il pittore lo seguirà presto a mano che Tosca non acconsenta a diventare sua amante; questo è il prezzo da lui stabilito. Straziata, la cantante, dopo una accorata preghiera al Signore, chiedendo il motivo di tante sofferenze (Vissi d'arte) accetta il ricatto chiedendo però che il suo compagno sia graziato all'istante. Spoletta entra annunciando che Angelotti si è ucciso per sottrarsi all'arresto. Scarpia intanto spiega a Tosca che non gli è possibile fare grazia aperta, ma ordina che la fucilazione di Cavaradossi sia solo simulata. Segretamente annulla questo ordine. Firmato un salvacondotto per Tosca e per Cavaradossi, Scarpia, non riuscendo più a trattenere il desiderio cerca di abbracciare la donna, ma questa afferra fulmineamente una lama e lo pugnala al cuore. Tosca appoggia un crocefisso sul petto di Scarpia, sottrae il salvacondotto e fugge dalla stanza.

All'alba Cavaradossi è condotto fuori dalla sua cella. Si odono le campane che suonano ed il canto di un pastorello che accompagna il gregge. A Cavaradossi resta un'ora di vita: offrendo un anello ad un custode lo convince a recapitare a Tosca un biglietto. Mentre scrive Mario è sopraffatto dal ricordo delle ore d'amore passate con la sua Tosca (E lucevan le stelle). Ma la donna compare improvvisamente per avvertirlo che la fucilazione sarà solo simulata e rivela a Mario di avere ucciso Scarpia e di avere sottratto il salvacondotto. Gli amanti si abbandonano al pensiero della futura felicità.
Mentre si abbracciano giunge il plotone di esecuzione, e Tosca raccomanda a Mario di cadere con arte. La fucilazione ha luogo ma quando, allontanatosi il plotone, Tosca accorre per colmare di baci il suo amato e aiutarlo ad alzarsi per fuggire, sotto il mantello che i soldati hanno gettato sul corpo del condannato trova un cadavere.
Scarpia ha tramato contro di lei l'ultimo inganno. Si odono voci confuse avvicinarsi: è stata scoperta l'uccisione di Scarpia, e Spoletta con i soldati si precipita verso Tosca per arrestarla. Tosca salita sul parapetto del castello si getta dagli spalti sfidando Scarpia "Avanti a Dio" in un'ultima crudele lotta ultraterrena.